——摘自：2004年美国《生命科学》杂志

 鲁庆荣   芩信棠   周永昌

香港大学医学中心玛丽皇后医院外科系

香港薄扶林道

摘要：

　　研究了复方中药珠香丸对MDA-MB-231乳腺癌细胞和正常人乳腺细胞生长曲线。用WST-1法测定了珠香丸、表阿霉素、5-氟尿嘧啶和环磷酰胺对细胞增殖的抑制作用。应用流式细胞仪和原位调亡标记试剂盒，以TUNEL技术测定DNA断裂的方法研究了凋亡作用。增殖指数和细胞周期的变化分别以Ki-67和碘丙啶作为批示剂用流式细胞仪测定。结果表明珠香丸有明显的抑制细胞增殖作用并与剂量相关。珠香丸的抑制作用大于常用的细胞毒药物。诱导细胞凋亡而形成的抑制作用依浓度和时间而变化。统计学处理表明对DNA主要作用于细胞的S期。用ATP生物荧光法测定乳腺癌细胞的活力表明珠香丸具有细胞毒作用。三种不同浓度的珠香丸均显示了抑制实体瘤的增殖作用。珠香丸能有效地抗乳腺癌。

关键词：珠香丸；细胞凋亡；细胞周期；乳腺癌

引言：

　　中药在中国应用很久，虽然主要是中国人应用，而现在也获得了中国以外的癌症患者的赞许【11】【25】。为了探索有效的抗癌药和治疗癌症，已经引起研究人员去调查天然药物用于癌症的效果。中草药疗法经常是无条件赠送的或者是替代疗法而不是主流疗法。【2】。一般认为中草药的活性是许多中药成分以一定比例配合才起到抗癌细胞的作用。中国的临床经验表明中草药是有效的，但缺少科学依据。珠香丸就是这样一种药物，其成分为麝香、半枝莲、黄芪、珍珠、莪术、当归、甘草等。已有报导上述单个草药或混合应用可能有诱导细胞凋亡作用【7】【12】【16】。最近报导用WST-1四氮唑比色法评估抑制细胞生长作用。或用三磷酸腺苷生物荧光法检测细胞代谢率【17】【10】。无论如何凋亡作用需要用原位凋亡标记技术和“末端脱氧核酸转移酶dUTP缺口末端标记法（TUNEL）”试验以证实DNA断裂。【16】【5】。三磷酸腺苷生物荧光法可检验药物对乳腺实体癌的作用。珠香丸是复方中草药制剂，用于治疗乳腺癌。但在医学文献中尚未见药理研究报导，本研究依据细胞生长曲线和对实体癌的作用证实珠香丸具有抗乳腺癌的作用。

材料与方法：

珠香丸试样制备：珠香丸由中国长春市抗癌药物研究所提供。系由麝香、半枝莲、黄芪、珍珠、莪术、当归、甘草等经提取浓缩精制而成的丸剂。经过香港有关部门检验，证实其重金属和微生物限度符合国际安全标准，并未检出微生物。为了更好地保证实验质量，取珠香丸50g用甲醇500ml提取三次后，残渣以二甲亚砜溶解，浓度为100mg/ml，并于4℃保存。临用时以Hank’s Balanced溶解（卡尔斯巴德尔盐，美国，加利福利亚Invitrogen公司）稀释成10mg/ml，用0.22醋酸纤维膜（美国，纽约，Corning公司）滤过除菌。

WST-1法测珠香丸、表阿霉素、环磷酰胺、5-FU对增生率的影响：

细胞增生率测定试剂：WST-1，德国曼赫姆，罗克公司。

MDA-MB-231乳腺癌细胞：美国 Manassas VA的Type培养集团公司

96孔微生物培养板：美国Massachusetts的Costar公司

每孔中加入4000个细胞，用Leiboritz氏L-15培养基加10%FBS，于含95%空气的二氧化碳中37℃培养。珠香丸连续稀释为8种不同浓度，于24小时后，每孔加200μl。分别于接种1、3、5、7天后，每孔中加10μlWST-1，于37℃培养1小时。用血小板计数仪（美国，VT，Winooski的Bio-Tek仪器公司）。在450nm波长下读取光密度。以同法得出临床上常用的5-FU(0.5ug/ml),表阿霉素(50ng/ml)和环磷酸酰胺(0.5ug/ml)的数据。

珠香丸对正常人细胞的毒性试验：

正常人细胞用的是正常人乳腺细胞CRL7366(美国ATCC提供)。用96孔培养板，每孔放4000个细胞，用Dulbecco氏方法，Eagle氏培养基加10%FBS于含95%空气的二氧化碳中，37℃培养。培养方法与细胞毒的检测方法与上述MDA-MB-231癌细胞生长曲线相似。

用DNA断裂检测法测定细胞凋亡：

将1×106个细胞置于100×15㎜培养皿中，按前述同样条件培养。细胞凋亡测定应用DNA梯试剂盒（德国罗克公司）。在指定时间用1mg/ml，2mg/ml和4mg/ml的珠香丸作用于细胞。在取样日，以胰酶处理，并用磷酸缓冲液洗涤。经1000转离心10分钟后，以滤柱分离细胞的DNA，并以缓冲液洗脱DNA于1.5ml试管中。将带有不同组DNA的缓冲液，加于2%琼脂糖的样品胶带，胶带槽加TBE缓冲剂（美国加州Invitrogen公司）以80伏电泳1小时。应用胶带文件系统（美国勃兰德的UVP公司）以紫外光显影检测DNA梯。

凋亡标记方法：

将乳腺癌细胞接种于无菌的孔径12㎜的24孔培养板（美国Coming公司）。每孔105个细胞。珠香丸以4mg/ml，2mg/ml和1mg/ml的剂量加于含10%胎牛血清的L-15培养基中，并加入孔中。空白用同样的培养基24小时。于加药后第1、3、5、7日用2%多聚甲醛固定细胞。应用原位标记凋亡测定试剂盒（美国Intergen公司）检测细胞凋亡。应用美国Roper Scientific公司的Coolsnap系统和描绘仪（美国Metamorph-Winshell, Universal Imaging公司）分析各组试验数据。

流式细胞仪分析：

细胞增殖，细胞周期中细胞分布和凋亡百分率应用TUNEL法（末端脱氧核酸转移酶dUTP缺口末端标记法）经XL-MCL流式细胞仪（美国，迈阿密Coulter公司）测得。乳腺癌细胞按前述同样的条件培养于100㎜2的培养皿，每皿106个细胞。空白及加珠香丸（浓度1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml），在规定时间收集，固定，并用Ki-67（美国，迈阿密Immunotech公司）和碘丙啶（美国Sigma公司）染色，在细胞周期的不同阶段测定细胞的增生与分布。另一方面，用MEBSTAIN凋亡试剂盒（美国，迈阿密Coulter公司）检测凋亡情况，并应用该公司的Mod Fit软件分析数据。

应用三磷酸腺苷生物荧光法检测人实体瘤：

研究分为四组，珠香丸浓度分别为空白组和1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml组。取1㎜3的人乳腺实体瘤，分别置于6孔板中，培养24小时。珠香丸组加入D-MEM/F-12(加15%胎牛血清的Dulbecco’s改良培养基)，15ml HEPES缓冲液，L-谷酰胺，盐酸VB6,青霉素（100U/ml），链霉素（100μg/ml），和胰岛素（4μg/ml）。再以24小时为周期培养，收获日加缓冲液溶解细胞，用超声器加速溶解，以增加ATP的释放。于420nm波长以TD-20/20型荧光计（美国加州Turner Designs公司）读取吸收值。荧光光密度指示三磷酸腺苷量。

统计分析：

试验数据统计学意义应用SPSS(11,USA)One-Way ANOVA分析。

结果：

WST-1 四氮唑比色法分析：

珠香丸、表阿霉素、环磷酰胺、5-FU对增殖率的影响通过平均光密度测得（表1）。在标定的日期内珠香丸组与对照组无显著差异。

 凋亡百分率：

      随着使用珠香丸剂量的增加，细胞数显著地减少（P＜0.05）。在第三天抑制作用很显著，1mg/ml  P=0.007；2mg/ml  P=0.05；4mg/ml  P＜0.001。图1表示凋亡之百分率，图2表示增殖率。珠香丸4mg/ml剂量时所有时间点均具有显著的统计学意义。

 图1：珠香丸的细胞凋亡指数随其剂量增加而递增

图2：珠香丸对细胞增殖率的影响；不同浓度间无显著差异。

细胞增殖率：

表2表明在S期，1mg/ml，2mg/ml和4mg/ml的珠香丸作用3天，平均细胞增殖率有显著差异。在4mg/ml的珠香丸作用下，细胞增殖在G1和S期受到阻碍。增殖率有显著差异。

珠香丸和常用细胞毒药物的比较：

图3表明珠香丸、5-FU、表阿霉素和环磷酰胺在抑制氧50%时的浓度分别为2mg/ml、0.5ug/ml、50ng/ml和0.5ug/ml。珠香丸的抑制作用显著大于所试验的细胞毒药物（P＜0.005）。也与细胞毒药物联合应用有显著差异（P＜0.005）。

图3 珠香丸与常用细胞毒药物抑制细胞增生作用的比较。珠香丸的抑制作用显著大于单独或联合使用的5-FU、表阿霉素和环磷酰胺。

应用三磷酸腺苷生物荧光法检测人实体瘤：

在用不同浓度的珠香丸抑制人实体瘤24小时后，测定ATP量与对照组有显著差异，但与剂量间无比例关系。

图4  2mg/ml珠香丸诱导MDA-MB-231细胞凋亡

（应用原位凋亡试剂盒测取）

图5  珠香丸作用3天对DNA断裂的影响：

1.bpDNA梯   2.对照   3.珠香丸1mg/ml   4.珠香丸2mg/ml

讨论：

许多研究者认为复方中药没有直接细胞毒作用，【9】抗癌中药的特点与巨噬细胞有关，通过细胞质变化而体现细胞毒作用。【6】我们的研究表明珠香丸能够抑制乳腺癌细胞，其抑制细胞生长类似于细胞毒药物，但对正常细胞生长曲线没有特别作用。细胞毒药物是通过诱导细胞凋亡而发挥其作用的。【4】本研究通过DNA断裂实验和TUNEL测定表明珠香丸能诱导凋亡乳腺癌细胞。【3】【19】有趣的是诱导指数因珠香丸剂量增加而增加，但增殖指数与对照组无甚差别。所以珠香丸可能通过诱导细胞凋亡起作用，这是和一些报导一致的。【13】【22】细胞周期的研究表明珠香丸集中作用于S期，提示珠香丸是影响细胞周期的抗癌药。研究结果进一步表明其作用与浓度和时间有依赖性关系。珠香丸明显作用于S期，对DNA作用大于RNA。【14】不像其他天然药物，如大豆提取物作用于G2-M期。珠香丸的作用类似于常用阻碍S期的细胞毒药物。【21】【27】【23】通过DNA断裂试验和TUNEL试验均证明了表阿霉素、5-FU和环磷酸酰胺的诱导细胞凋亡作用。【26】【8】【18】【1】【24】临床试验表明联合用上述药物治疗乳腺癌有效。【20】【15】本研究通过上述两种试验表明珠香丸与这些细胞毒药物一样有致癌细胞凋亡作用。（图4和图5）一期临床试验已经在中国长春完成。

细胞毒药物常以静脉给药，经常发生不良副作用。而中草药如珠香丸则未见报导。因细胞毒药物为单一化合物，故很容易进行作用机制的研究。而复方中药含有很多潜在的活性组分，这些不同活性物质按一定比例混合才起作用。我们实验结果提示珠香丸可以作为有效的抗癌剂。因为它们是协同作用。珠香丸的作用很易重复和有根据证明。简而言之，我们认为珠香丸因阻碍S期而抑制乳腺癌细胞生长。它诱导乳腺癌细胞凋亡作用与其它细胞毒化疗药类似。除此以外，珠香丸可以降低乳腺癌患者实体瘤的代谢率。分子水平的研究有待进一步探索。

参考文献：

[1] Cai,L.,Hales,B.F.,Robaire,B.,1997.Induction of apoptosis in the germ cells of adult   male rats after exposure to cyclophosphamide. Biology of Reproduction 56(6),1490-1497.

[2] Cassileth,B.R.,1999.Evaluating complimentary and alternative therapies for cancer patients.CA-A Cancer Journal for Clinicians 49,362-375.

[3] Chen,J.C.,Chung,J.G., Chen,L.D.,1999.Gypenoside induces apoptosis in human Hep3B and HA22T tumour cells. Cytobios 100,37-48.

[4] Eastman,A.,Rigas,J.R.,1999.Modulation of apoptosis signaling pathways and cell cycle regulation. Seminars in Oncology 26,7-16.

[5] Garrity,M.M.,Burgart,L.J.,Riehle,D.L.,Hill,E.M.,Sebo,T.J.,Witzig,T.,2003. Identifying and quantifying apoptosis navigating technical pitfalls. Modern Pathology 16(4),389-394.

[6]Haranaka,K.,Satomi,N.,Sakurai,A.,Haranaka,R.,Okada,N.,Kobayashi,M.,1985.Antitumor activities and tumor necrosis factor producibility of traditional Chinese medicines and crude drugs. Cancer Immunology Immunotherapy 20,1-5.

[7] Jin,Y.H.,Yim,H.,Park,J.H.,Lee,S.K.,2003.Cdlk2 activity is associated with depolarization of mitochondrial membrane potential during apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications 305(4),974-980.

（香港大学医学中心玛丽皇后医院外科系 鲁庆荣 芩信棠 周永昌）

于2004年